1 概要
 依頼者が作製したDNA溶液(ベクター部分を除く)をマウス受精卵の前核中に注入し、仮親の卵管内へ移植を行ってマウスを誕生させます。生まれたマウスは離乳(生後約4週齡)までセンターで飼育します。離乳後、スクリーニングを依頼されない場合は、すべてのマウスを依頼者に送付します。スクリーニングを依頼される場合は、スクリーニング後、遺伝子導入が確認されたマウスのみを送付します。
2 作製の手順
  1. 「遺伝子改変マウス作製等申込書(別記様式第1号)」及び「遺伝子組換え実験計画承認書・実験計画書(様式1及2)」を送付してください。(記入例を参照して作成してください。本学内において必要な組換えDNA実験計画などの手続きをとります。)
     なお、依頼者は必要に応じてその所属する大学などの長へ「遺伝子組換え実験計画承認書・実験計画書(様式1及び2)」を提出し、実験の承認を受けてください。承認がありませんと、センターが作製した遺伝子導入マウスの供与を受けることができない場合がありますのでご注意ください。
  2. 1と同時に、注入用DNA溶液も送付してください。注入用DNA溶液を受け取った時点で、順番待ちリストに記載します。
  3. 組換えDNA実験等の手続き終了後、本学から請求書が送付されますので、これにより作製料金を納入してください。
  4. 料金の納入を確認後、遺伝子導入マウスの作製を開始します。
  5. 作製を完了したマウスを専門業者に依頼して発送します(インジェクションを開始してから約2ヶ月後)。
  6. なお、マウスを発送するための費用(マウスの輸送用箱、輸送運賃など)、第三者検査機関による微生物検査費用は、マウス作製料金には含まれていませんので、別途お支払いください。
3 注意事項
  1. 注入遺伝子の構造
    遺伝子改変マウス作製等申込書の「異種のDNA分子、組換えDNA分子又は組換え体」欄に導入遺伝子の簡単なマップとサイズを記入してください。なお、遺伝子名は記号のみ表記するのではなく、その内容をわかりやすく簡潔に記入してください。
  2. マウスの系統
    C57BL / 6 x DBA2 (BDF1)マウスまたはC57BL / 6マウス
  3. cDNAの導入の場合
    cDNAの導入を計画されている方は、Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 : 4438-4442, (1985)を熟読されることをお勧めします。なお、イントロン付きベクターが必要な方はご相談ください。
  4. 注入用DNA溶液の調整
    注入用DNA溶液は調整のうえ送付してください。Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 : 4438-4442, (1985)を熟読されることをお勧めします。注入するDNA溶液は遺伝子導入効率や遺伝子発現に大きく影響しますので、下記の点に注意して調整してください。
       線状ゲノムDNAで、できるだけベクターDNA部分を除くこと。
       DNA濃度:50μg/ml
       DNA量:100μl (50μl / tubeを2本)
       DNAの精製法:Tgマウス作製に用いられる方法に準じて作製してください。
  5. DNA溶液の送付
    DNAを入れたチューブには、必ず、氏名、DNAを記入し、パラフィルム等でシールしてください。
    DNAは4℃で発送してください。
    濃度調整後のDNAの泳動写真を必ず同封してください。
  6. マウス受精卵への遺伝子の導入
    マウス受精卵に遺伝子の導入を開始してから、約2ヶ月後(受精卵に遺伝子を導入してから約3週間後にマウスが生まれ、それから約4週間後に離乳します。)にマウスを発送します。
    約200〜300個のマウスの受精卵に遺伝子を注入し、それを仮親マウスの卵管内に移植して出産させます。
  7. 導入遺伝子のスクリーニング
    導入遺伝子のスクリーニングまで依頼する時には、スクリーニング用のPCRプライマーセット、PCRの反応条件、その条件でPCRを行った時の電気泳動写真を必ず同封して下さい。遺伝子導入が確認されたマウスのみを送付致します。
    スクリーニングの依頼がない場合には、離乳したマウスをすべて依頼者に送りますので、DNAの解析等は各自で行ってください。なお、F0マウス(発送するマウス)のDNA解析は、一度はサザン法で確認することをお勧めします。
4 供給するマウスの微生物学的品質
 遺伝子改変マウスの作製には、SPFマウスを使用し、飼育室の微生物モニタリング成績証を供給するマウスに添付します。胚移植後のマウスは、専用飼育室で飼育します。委託者が第三者検査機関による微生物検査を必要とする場合は、作製したマウスが離乳後、その仮親を第三者検査機関にて委託者の必要な項目について検査し、供給マウスにその検査成績証を添付します。微生物感染については、最大限の注意を払っておりますが、供給するマウス自体の納入時の微生物学的状況を保証することは困難です。飼育室への搬入にあたり、必要に応じて、一定期間の隔離、検疫等の対応をお願いします。なお、凍結受精卵での供給も可能です。
---参考書---
Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd Edition
B. Hogan, R. Beddington, F. Costantini, E.Lacy
Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1994
(お申し込み、お問い合わせ先)
〒305-8575 茨城県つくば市天王台1-1-1
筑波大学生命科学動物資源センター
資源開発分野
高橋 智
Tel : 029-853-7516
Fax : 029-853-6965
e-mail :satoruta@md.tsukuba.ac.jp
  • 1 概要
     依頼者が作製した変異導入ES細胞を、そのES細胞が129系マウス由来の場合はC57BL/6マウスの胚盤胞内に、TT2細胞由来の場合はICRマウスの8細胞期胚に注入します。C57BL/6マウス由来の場合は、ICRマウスのテトラプロイド胚とのアグリゲーションキメラを作製します。ES細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させます。生まれたマウスは離乳後(生後約4週齡)までセンターで飼育します。離乳後、毛色キメラマウスを依頼者に送付します。スクリーニングは、依頼者が行ってください。
    2 作製の手順
    1. 「遺伝子改変マウス作製等申込書(別記様式第1号)」及び「遺伝子組換え実験計画承認書・実験計画書(様式1及び2)」を送付してください。(記入例を参照して作製してください。本学内において必要な組換えDNA実験計画などの手続きをとります。)
       なお、依頼者は必要に応じてその所属する大学などの長へ「遺伝子組換え実験計画承認書・実験計画書(様式1及び2)」を提出し、実験の承認を受けてください。承認がありませんと、センターが作製した遺伝子導入マウスの供与を受けることができない場合がありますのでご注意ください。
    2. 1と同時に、変異導入ES細胞も送付してください。変異導入ES細胞を受け取った時点で、順番待ちリストに記載します。
    3. 組換えDNA実験等の手続き終了後、本学から請求書が送付されますので、これにより作製料金を納入してください。
    4. 料金の納入を確認後、キメラマウスの作製を開始します。
    5. 作製を完了したらマウスを専門業者に依頼して発送します(インジェクションを開始してから約2ヶ月後)。
    6. なお、マウスを発送するための費用(マウスの輸送用箱、輸送運賃など)は、第三者検査機関による微生物検査費用は、マウス作製料金には含まれていませんので、別途お支払いください。
    3 注意事項
    1. ES細胞の準備
       導入遺伝子1件について、準備するES細胞は2クローンです。なお、遺伝子改変マウス作製等申込書の「異種のDNA分子、組換えDNA分子又は組換え体」欄に凍結チューブ(1クローン/1チューブ)内に含まれるES細胞数を明記してください。
    2. ES細胞の送付
       ES細胞を輸送するための輸送容器(液体窒素を使用)が必要な場合はご相談ください。なお、輸送容器は宅配便で送付できます。
    3. ES細胞のインジェクション
       通常、2クローンのES細胞を合計約200個の8細胞期胚または胚盤胞内に注入し、そのマウス胚を仮親マウスの子宮内に移植してキメラマウスを出産させます。テトラプロイド アグリゲーションの場合は約100個の胚を移植します。
    4. ES細胞の善し悪し
       ES細胞を用いたキメラマウスの作製は、ES細胞の善し悪し(培養状態)によりキメラマウス(またはジャームライン・キメラ)がまったく得られないケースがあります。その場合は、これまでの経験より、ES細胞自体に問題がある場合が多いと考えられます。インジェクションを行ってもキメラマウスが得られない場合や、ジャームライントランスミッションしない場合には、責任を負いかねますのでご了承をお願いします。なお、同じES細胞でもう一度行うことは勧められませんし、新たなES細胞で行うときは、新たな依頼として費用を請求いたします。 
  • ---参考書---

    Gene Targeting, A Practical Approach
    A.L.Joyner
    Oxford University Press, 1993 

  • ---備 考---
    1. 遺伝子改変マウスが得られなかった場合の対処について
       通常のインジェクションでTgマウス又はキメラマウスが得られなかった場合、これまでの経験から、それは導入技術の不備によるものではなく遺伝子産物自体に何らかの毒性があり、発育途上で死に至ると考えられます。したがって、同じ遺伝子でもう一度行うことは勧められませんし、異なった構造の遺伝子で行うときは、新たな依頼として費用を請求します。
    2. Tgマウス及びキメラマウス作製に関する事前相談について
       事前に導入遺伝子のコンストラクト及びターゲティングベクターの構築等の研究内容に関する事前相談があった場合は、共同開発として特許権を主張することがあります。
    (お申し込み、お問い合わせ先)
    〒305-8575 茨城県つくば市天王台1-1-1
    筑波大学生命科学動物資源センター
    資源開発分野
    高橋 智
    Tel : 029-853-7516
    Fax : 029-853-6965
    e-mail :satoruta@md.tsukuba.ac.jp

    1 概要

     依頼者が作製したターゲティングベクターをES細胞(E14 / 129Svマウス由来、もしくはC57BL/6Jマウス由来)にエレクトロポレーションし、G418耐性のコロニーを選択します。耐性コロニーを24ウエルのプレートにピックアップし、PCR法で相同組換え体の同定を行います。同定された相同組換え体を6ウエルのプレートに移して培養し、5本のES細胞ストックを保存します。細胞の保存後、残りのES細胞よりDNAを抽出し、サザン解析を行い相同組換え体を確定します。作製料金は、筑波大学生命科学動物資源センター遺伝子改変マウス作製等受託規程により、請求いたします。

     

    2 作製の手順
    1. 「遺伝子改変マウス作製等申込書(別記様式第1号)」を押印のうえ送付してください。(記入例を参照して作成してください。)
    2. ターゲティングベクターの構築については相談に応じます。
    3. 料金の納入を確認後、変異ES細胞の作製を開始します。
    3 注意事項
    1. ターゲティングベクターの作製及びPCRスクリーニングの条件の設定
       ターゲティングベクターの作製は、原則として依頼者自身で行ってください。ターゲティングベクターの作製まで依頼される場合は、御連絡ください。ターゲティングベクターのデザイン、作製用のベクター等については相談に応じます。スクリーニングは原則としてPCRで行います。ターゲティングベクターの作製と同時にPCRテストベクターを作製し、PCRの条件を設定してください。詳細はお問い合わせ下さい。
    2. ES細胞
       ES細胞については、筑波大学生命科学動物資源センター、資源開発分野で使用しているジャームライン・トランスミッションの可能性が高い細胞(E14 / 129Svマウス由来、もしくはC57BL/6マウス由来)を使用します。
    3. 相同組換え体のスクリーニング
      相同組換え体のスクリーニングはPCR法で行います。PCR法の実験デザイン、検定方法は御相談ください。
      スクリーニングは初回120コロニー、2回目は、初回の相同組換え体の得られた頻度により、最終的10クローン以上の組換え体クローンが得られるように行います。
    4. 注入用DNA溶液の調整
       ・依頼者が調整してください。方法等については御相談ください。
       ・1回のエレクトロポレーションで80μgの線状DNAを使用します。
    5. 相同組換えの頻度
       相同組換えの頻度は、ターゲティングをしようとする遺伝子、ベクターの構築により大きく変化します。これまで行った70以上の遺伝子ターゲティングの経験から、相同組換え体が得られない場合は、手技的問題よりも上記2つの問題である場合が多いと考えられます。従って、組換え体が得られない場合はターゲティングの方法を変更することをお勧めします。方法等については御相談ください。
    (お申し込み、お問い合わせ先)
  • 〒305-8575 茨城県つくば市天王台1-1-1
    筑波大学生命科学動物資源センター
    資源開発分野
    高橋 智
    Tel : 029-853-7516
    Fax : 029-853-6965
    e-mail :satoruta@md.tsukuba.ac.jp


  • 1 概要
    遺伝子改変マウスの作製に用いるマウスとして、日本チャールスリバー、日本クレア、エスエルシー、いずれかのSPFマウスを使用し、専用飼育室のラミナーフローラックで飼育します。定期的微生物モニタリングは、年に4回、(財)実験動物中央研究所が行う微生物検査項目(培養I、血清反応I、鏡検I:下記参照)および方法に準じて、当センターが行います。
     また、胚移植後のマウスおよび誕生したマウスは、専用飼育室のラミナーフローラックで飼育します。委託者が第三者検査機関による微生物検査を必要とする場合は、作製したマウスが離乳後、その仮親を第三者検査機関にて委託者の必要な項目について検査し、供給マウスにその検査成績証を添付します。第三者機関による検査費用は別料金です。
    2 微生物検査項目

     この項目は、(財)実験動物中央研究所が行う微生物検査項目(培養I、血清反応I、鏡検I)に準じ、国立大学動物実験施設協議会の「実験動物の分与に関するガイドライン(9905案)」において定めた「minimum」の病原微生物に加え、病原性や発生頻度を考慮し、微生物モニタリングとして重要度が高いものを対象としています。

    培養検査

    • Pasteurella pneumotropica
    • Salmonella spp.
    • Citrobacter rodentium
    • Corynebacterium Kutscheri
    • Salmonella Typhimurium

    血清検査

    • Sendai virus
    • Mouse hepatitis virus
    • Ectromelia virus
    • Mycoplasma pulmonis
    • Clostridium piliforme(Tyzzer's organism)
    • LCM virus

    顕微鏡検査

    • 消化管内原虫
    • 蟯虫
    • 外部寄生虫
    (お問い合わせ先)
    (申請書類等のご送付先)
    〒305-8575 茨城県つくば市天王台1-1-1
    筑波大学生命科学動物資源センター
    資源管理分野
    八神健一
    Tel : 029-853-3386
    Fax : 029-853-3380
    e-mail :kenyagam@md.tsukuba.ac.jp
    〒305-8575 茨城県つくば市天王台1-1-1
    筑波大学生命科学動物資源センター 事務室
    Tel : 029-853-3382
    Fax : 029-853-3380