研究方法

１　検体収集体制と共通診断基準

　ヒト疾患の遺伝子解析で最も重要な点は、質の高い検体を大規模に収集することである。そのためのオールジャパンでの検体収集体制をゲノム班がコアとなり、痴呆疾患診療を専門とする大学及び民間病院を包括したコンソ−シアムを組織し、「アルツハイマー病ゲノム収集ネットワーク」として全国規模で試料の収集を行なった。試料提供に協力いただけた協力施設名と研究責任者及び分担者名は本報告書の後方に記載した。検体収集とその解析に当たっての重要な拠点の研究者は計画班員（計画班友）とした。班員（班友）は、荒井啓行（班長、東北大学）、朝田　隆（筑波大学）、井原康夫（東京大学）、今川正樹（今川クリニック）、浦上克哉（鳥取大学）、桑野良三（新潟大学）、東海林幹夫（岡山大学）、樋口　進（久里浜アルコール医療センター）である。検体収集に先立ち、共通の診断基準を作成し、「アルツハイマー病診断・評価基準試案」としてまとめた（東海林幹夫ら、臨床神経学　４５：１２８−１３７、２００５）。試料収集に際しては、「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」に従って各研究機関において遺伝子倫理審査委員会の承認を受けた。試料は各試料提供研究機関にて匿名化して新潟大学に集め、Niigata Genotyping Center (NGC)にて一括して解析を行なう体制とした。
　孤発性アルツハイマー病2147例（75.5±8.9才；女性71％、男性29％）、健常対照2486例（71.5±8.9才；女性60％、男性40％）から末梢血液検体を収集した。年齢、性別、APOE遺伝子型などによる層別解析が可能な目標の2000例以上の収集を達成した。アルツハイマー病の他に、軽度認知障害(MCI)101例、血管性痴呆120例、レヴィー小体型痴呆65例、パーキンソン病49例、その他の変性脳疾患などの症例が集まっている。この中で442例については剖検による病理診断がなされている。
　健常対照者は、班員が、宮城県、茨城県、神奈川県、島根県の各自治体の協力を得て健康高齢者を対象とした地域疫学調査におけるボランティア、または患者の配偶者、親族などによって構成されている。
　アルツハイマー病同胞発症例の収集は当初は困難なものであった。まず、日本神経学会、老年医学会、老年精神医学会の会員にアルツハイマー病同胞発症例の有無につきアンケート調査を行った。アルツハイマー病同胞発症例を有する開業医の場合などは、新潟大学遺伝子倫理審査委員会において代理審査を行なった。遠隔地の兄弟発症例は家族から紹介して頂き、担当医またはゲノム班員が直接出向いて採血した。平成17年1月までに、57家系124人の同胞発症例から試料を収集した。

２　分析方法

　診療情報データベース構築と個別タイピングを効率良く進めるために、匿名化されて送られてきた試料すべてに、再度統一的な9桁の数字(2xxxxxxxx)からなるNGCID番号を付与した。試料提供研究機関毎に区分してBOX（96サンプル）単位で、鍵のかかるフリーザーに保管・管理した。質、回収率、時間、経費を比較検討した。研究に対する理解と期待から提供された貴重な試料であることを考慮して「質と回収率」が最も良かったQuiagen抽出キットを採用し手動によって丁寧に抽出した。血清学検査の後のクロット（凝血塊）からも効率よく高品質のDNAを抽出できた。手動によるため時間と労力は増したが、タイピングの精度・成功率は非常に高くなった。DNA濃度測定は、分光光度計260nm測定によるRNAのコンタミを避け、ピコグリーン測定法を使用した。
　マイクロサテライト検索は、以下のように行なった。1）UniSTSに公開されているマイクロサテライト情報、それらのゲノム上の物理的位置、PCR産物のサイズ、PCRプライマーのＴｍ値計算、登録されている遺伝子名を染色体毎に一覧表にして出力する。同時に、全ゲノムシークエンスデータから、各マイクロサテライトについて上下流の各400bp塩基配列をから切り出し貼り付ける。2）市販のマイクロサテライトマーカーおよび公開データベースに登録されてないマイクロサテライトを検索する。2塩基から5塩基の繰り返し配列（Short Tandem Repeat，STR=マイクロサテライト）を全ゲノム配列から取り出す（ＳＴＲ検索ソフト）。新たに見つかったSTRの上下流の配列から400ｂpを切り出して、PCR産物のサイズ、PCRプライマーのＴｍ値計算を行って、適切なＰＣＲプライマー設定が行う。これによって速やかに新規マーカーを設定することができた。

３　解析結果

　収集した試料には、65才以下の症例、ＭＣＩ、血管性痴呆、レヴィー小体型痴呆などが含まれていたので、これらを除いて、ＡＤ1650人（73.5±6.6才；女性1191人、男性459人）、対照群1383人（73.5±7.8才；女性840人、男性543人）を解析の基本対象とした。試料全体におけるAPOE遺伝子型は、ＡＤ群では、APOE4＊4，9.6％；3＊4，40.1％；3＊3、45.8％、2＊4，1.2％：対照群でAPOE4＊4，1.2％；3＊4，15.2％；3＊3，75.0％，2＊4，1.0％であった。このAPOE遺伝子型は、試料提供研究機関が異なるゲノム班員及び拡大コンソシアムのいずれにおいてもほとんど同じであったので、均一な試料であることが分かった。健常対照群の大半は地域をベースに収集したので、地域による差が疾患感受性遺伝子同定に影響を与えては意味が無い。そこで、宮城県、茨城県、神奈川県、島根県のそれぞれが地域性を反映するかどうかをAPOE遺伝子型で検定したところ、いずれも地域による差は無かった。従って、収集した大量のＡＤ群ならびに健常対照群を等しく取り扱うことができる。

●マイクロサテライトによる全ゲノム解析
　全ゲノムについて5ｃＭ間隔（811マーカー）で、ＡＤ（695人）対照群（744人）を対象として相関解析のために一次スクリーニングを行った。偽陽性を含めて69座位（Ｐ値＜0.05）について、新たなサンプルセットを準備して二次スクリーニングを開始した。マイクロサテライトは多型が多い利点があるが、波形の解析が複雑で時間を要する欠点がある。しかし、これまでの欧米人には報告がない染色体の座位が候補に挙がっているので日本人固有の感受性遺伝子の発見に期待がもてる。

●染色体19番及び10番のマイクロサテライト解析
1）染色体19番について、高密度マイクロサテライトを用いた相関解析を行った。公開データUniSTS （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に登録されている染色体19番のマイクロサテライト2641座位の中から273座位を選別し、ＰＣＲ増幅に問題のあるものや日本人で多型がないものを除いて215座位についてタイピングを行った。一次スクリーニングで候補となった26座位について二次スクリーニングを開始した。APOEから最も近いＤ19Ｓ559（上流82ｋb）及びGDB:171136（下流38ｋｂ）は、χ二乗検定でＡＤと強く相関しなかった。そこで、独自に開発したSTR検索ソフトによって、APOEから上流36kbに設定新たにマーカー（19N7-RK708）をした。解析の結果、ＡＤと有意に（Ｐ値＝0.0000058）相関するマイクロサテライトを初めて発見した。これによってマイクロサテライトとSNPの関連について詳細な解析が可能となった。
2）染色体19番と同様に、染色体10番全体をカバーする364座位について相関解析を行った。一次スクリーニングで候補となった34座位について二次スクリーニングを開始した。

●ＳＮＰ解析
　　NPタイピングは、TaqMan法(ABI社)を採用した。経費削減と貴重なDNA量を有効に使用するため、および同じ条件で解析システムをフルに活用して大量処理するために、反応の微量化を行ない、ＤＮＡは前もって乾燥することにした。乾燥すれば数か月は保存ができるので、一度に大量の検体が処理できることがわかった。

●染色体19番のＳＮＰ解析
　APOEを挟んで2Mb内で多型が認められている110箇所（平均14kb間隔）のSNPを選び、ＡＤ372人、健常対照群372人について相関解析を行なった。APOEのみならず、APOE近傍の複数のSNPに強い相関がみられたので、その連鎖不平衡の範囲を決めるため、APOEを含む領域180kb内にある全てのSNP（311個所）について検討した。配列上TaqManプローブの合成不可が56 SNP、日本人で多型なしが94 SNPあった。よって、使用可能な162 SNPについて、ＡＤ677例その対照群744例のタイピングを行い詳細なハプロタイプ解析を行った。APOEを含む領域の連鎖不平衡ブロックは約50kbであることが解った。このブロックの中に、PVRL2、TOMM40、APOE、APOC1の遺伝子が存在していた。これらの遺伝子の中でアミノ酸置換を伴いＡＤ発症のリスクファクターとして機能するSNPがあるかどうかを調べた。全てのエクソンについてシークエンスを行いSNPの発見を試みたが、APOE以外の遺伝子にアミノ酸置換を伴うSNPは存在しなかった。しかし、プロモーター領域またはイントロン内SNP、small RNA、メチル化などゲノム構造に由来する遺伝子発現調節の変化は否定できないので、非常に困難ではあるが分子生物学的なアプローチによる解明は意義があると考える。この連鎖不平衡ブロック内に、新しく設定したマイクロサテライトマーカー19N708が含まれていた。

●染色体10番のＳＮＰ解析
　複数の欧米研究グループの連鎖解析の結果、有力な候補として染色体10番がある。一方、否定する報告もあるので、この領域10ｑ21-25（60-107Ｍｂ）に焦点を絞って、日本人固有の特にAPOEε4と独立した新しい感受性遺伝子の探索を行った。APOEの遺伝子型は全ての症例について、TaqMan法とDNAシークエンスを行って確定した。
　解析するSNPは、公開データとCelera社データを基に、アリル頻度が10％以上、隣のSNPとは5kb以上離れることを条件に1305 SNPを選んだ。日本人における多型の無いSNP、及びHardy-Weinberg平衡が0.05以上のSNPを除いた1193 SNP(平均SNP間距離、38.7 kb)を用いて網羅的に1次スクリーニングを行った。本スクリーニングの特徴は、対照群は将来発症するかもしれないので、ＡＤ65才以上に対して75才以上の高齢者を選んだ。APOE3*3のＡＤ363人（74.4±6.4才、女性249人、男性114人）対照群337人（80.3±4.0才、女性223人、男性114人）を対象とした。
　χ二乗検定で有意な（Ｐ値＜0.001）36 SNPについて異なるサンプルセット；APOE3*3のＡＤ351人（74.5±7.7才、女性250人、男性101人）対照群373人（75.6±4.6才、女性213人、男性159人）を用いて二次スクリーニングを行った。その結果、10q24.2の領域(101.42-101.66 Mb)がＡＤと有意に相関していた。HapMapプロジェクトによると、この領域は230kbの大きなハプロタイプブロックを形成していた。この領域には5つの遺伝子（ENTPD7,COX15,CUTC,ABCC2,DNMBP）が含まれていた。そのうちアミノ酸置換を伴うCOX15,ABCC2,DNMBPのいずれかまたはそれらが共同して、APOEε４の影響を受けずにＡＤ発症のリスクファクターとして機能していると考えられる。

●罹患同胞対解析
　これまでに収集した57家系124人の検体に家族性優性遺伝の原因遺伝子であるAPP、PSEN1、PSEN2並び関連遺伝子のMAPTに異常があるかを確認するために、これら4遺伝子の全58エクソンのシークエンスを行った。全例に既知または新規の配列異常は見出されなかった。高齢者の同胞発症例はこれらの原因遺伝子は関与してないことが解った。100サンプル以上集まったので、5ｃＭ間隔（811マーカー）のマイクロサテライトを用いてタイピングを行ったので、第1回目ノンパラメトリック連鎖解析を行う段階である。

４　成果のまとめと今後の展望

1）痴呆の専門医によるコンソ−シアムを組織し、綿密な連携によって全国的な大規模ゲノム収集をアルツハイマー病で初めて成功させた。2000例を越える試料は「アルツハイマー病診断・評価基準試案」に基づき、MRI、CT、SPECT画像所見、臨床心理テスト、罹病期間、治療経過などの重要な診療情報が付随した「質」の高いものであった。
2）高密度マイクロサテライトまたはSNPを多型マーカーに用いて染色体19番と10番を集中的に解析した。連鎖解析から染色体6番、9番、10番、12番、19番が有力視されている。これらすべての民族に共通した遺伝的危険因子に加えて、日本人固有の危険因子が存在する可能性は十分に考えられので、家系に基づく連鎖解析は重要である。そのためには、引き続き同胞発症例を収集する必要がある。
3）ゲノムワイド相関解析の成果の一つに、約500人の健常者マイクロサテライト（平均5ｃＭ間隔）アリル頻度データベースが出来た。この日本人アリル頻度を用いれば、家族内発症の疾患について連鎖解析が短時間に効率良く行える(このアリル頻度は近くホームページから利用できるように準備をしている)。
4）孤発性ＡＤについて、ApoE4遺伝子以外の感受性遺伝子はまだ認められていないが、染色体10番を19番と同じように、欧米人の連鎖解析の結果を利用して、高密度マイクロサテライトおよびSNPを多型マーカーとして、ミレニアムプロジェクトで推進した「質」の高い大量の試料を使って徹底的にタイピングを行えば、新たなＡＤ感受性遺伝子を発見できる可能性は非常に高いと思われる。

本研究は「先端脳ゲノム班」が中心となってオールジャパン体制で検体収集を行った。
先端脳ゲノム班員、班友：荒井啓行（班長、東北大学）、朝田隆（筑波大学）、井原康夫（東京大学）、今川正樹（今川クリニック）、浦上克哉（鳥取大学）、桑野良三（新潟大学）、東海林幹夫（岡山大学）、樋口進（久里浜病院）。
ＡＤゲノム収集ネットワーク：宮川太平（熊本労災病院）；宇山英一郎（熊本大学）；中川龍治、吉本静志（嬉野温泉病院）；山田達夫、高橋三津雄（福岡大学）；芹川佳代子（ものわすれメンタルクリニック）；杠岳文（肥前療養所）；岡田和悟（大田市立病院）；大矢輝美（瑞穂町役場）；徐武華，瓦林毅，松原悦朗，阿部康二（岡山大学）；甲平一郎（高知県立中央病院）；涌谷陽介、中島健二（鳥取大学）；渡辺憲（渡辺病院）；佐々木健、藤沢嘉勝、中田謙二（きのこエスポアール）；高尾武男、太田信子（倉敷平成病院）；早原敏之（いわき病院）；真鈴川聡（三重県立志摩病院）；小阪憲司、赤津裕康（福祉村病院）；高橋正彦（東京都老人医療センター）；吉井文均（東海大学）；浜野均（東日本循環器病院）；木村英雄、後藤雄一、南成祐（国立精神・神経センター）；篠遠仁（旭神経内科病院）；北村伸（日本医科大学）；羽生春夫（東京医科大学）；岩本浩之（初石病院）；長谷川一子（国立相模原病院）；池田将樹、甘利雅邦（群馬大学）；針谷康夫（前橋日本赤十字病院）；大塚美恵子（自治医科大学）；須賀政一、西野勲（東新潟病院）；竹内幸美、熊西敏郎（竹内病院、新潟長寿研究所）；森田昌宏、田中政春（三島病院）；本田建一（ほんだ病院）；中野亮一、小野寺理、西澤正豊、高橋均、柿田明美（新潟大学）；石川厚（阿賀野病院）、川瀬康裕（川瀬神経内科クリニック）；長谷川まこと（青山親愛会）；高橋丈夫（伊那神経内科病院）；新福尚武（ライフプランニングセンター）；伊藤潤造（アルパイン川崎）；藤井昌彦（山形つくしが丘病院）；高椅智（岩手医科大学）；布村明彦、千葉茂（旭川医科大学）

５　その他の研究成果

以上の解析は、新潟大学解析センターにおける桑野良三班員が中心となって行なったものであるが、その他の班員の個別研究を以下記載する。

荒井啓行（東北大学）は、免疫性神経疾患において末梢より投与された抗Aβ抗体を含有するγ−グロブリン製剤が、脳から血中へとAβを引き抜く可能性を示した。Aβ1-42に対する抗体価の高いロットを選択することで、今後さらにその効果を増強できるのではないかと推察された。
浦上克哉（鳥取大学）は、アルツハイマー病患者でプレセニリン1遺伝子変異をスクリーニングした結果、痙性対麻痺を伴う早発型アルツハイマー病患者1名においてY154N変異を見出した．また，晩発型アルツハイマー病患者１名においては、I202T変異を見出した．
朝田　隆（筑波大学）は、アルツハイマー病前駆状態または正常と判断された個人を中心に有酸素運動、栄養(EPA,DHA,リコペン、銀杏葉エキスから成るサプリメント)、短時間の昼寝習慣の形成による介入を400名弱を対象に開始した。認知機能テストなど各種の評価を、1年後の介入開始の時点、さらに介入開始から1年後に繰り返し行い、介入による知的機能、気分状態、体力面への効果を測定した結果、介入開始から1年後に、注目した5つの認知機能の中で記憶において優位な改善効果が得られた。また主観的なうつ気分のあっ人でも、それが改善するとともにうつの客観的指標とされる尿中コルチゾールも低下した。さらに有酸素能力、筋力、反射能力などにおいても改善が得られた。
東海林幹夫（岡山大学）は、Ｄown症１７８例（6歳から64歳）で血漿Aβ40とAβ42の加齢に伴う変化を検討した．Aβ40は生後に正常対照に較べ約8倍に増加しており，20歳まで急激に減少し，20歳代からは徐々に減少した．血漿Aβ42は20歳代で軽度上昇し，以後，次第に減少した．Down症ではAβ40の変化が著明であるため，Aβ ratioは同様に30歳代まで急激に低下し，以後，上昇した．正常対照と較べると，既に若年で変化が見られることを見出した。
樋口　進（久里浜アルコールセンター）は、脳脊髄液タウ（CSF-tau）値が、ウェルニッケ脳症患者で上昇することを見出した。しかし、振戦せん妄を有する症例では上昇していなかった。ウェルニッケ脳症の経過をみると、2点で評価できた9症例で、2回目のCSF-tau値はほぼ全例で正常に復していた。この点は慢性の経過を辿ったコルサコフ症候群症例ではCSF-tau値が上昇していなかったという結果と矛盾しない。ウェルニッケ脳症患者ではグリアととも急性の神経細胞死がまず始まり、その後比較的短期間のうちに神経細胞死は終息するが、組織の修復プロセスには長時間を要することが示唆された。